单核细胞增生李斯特菌特异性单链抗体磁珠的制备与评估（一）

单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）是单核食物中紧张的致病性微生物，也是细胞性单李斯特菌属内能引起肠胃炎、败血病、增生珠的制备脑膜炎以及李斯特菌病等最主要的李斯链抗病原体，致去世率达30%，特菌特异体磁对于免疫缺陷人群危害严正。评估该菌普遍存在于乳废品、单核肉废品、细胞性单蔬菜瓜果以及海产物等种种食物中，增生珠的制备能在pH4.0、李斯链抗高盐以及4℃情景中存活并孳生。特菌特异体磁

单核细胞增生李斯特菌的评估妨碍易被其同属内的此外细菌（如英诺克李斯特菌等）拆穿困绕，较难在哺育后分说取患上目的单核菌，导致假阴性检测服从。细胞性单免疫磁珠捉拿技术（I妹妹uno-magneticbeadstechnology，增生珠的制备IMBs）可在重大系统中特异性地捉拿目的微生物，取患上活菌体。IMBs的特异性依赖于所用抗体的功能，而抗体受制于破费工艺，其品质与产量都不晃动。与传统免疫血清、杂交瘤等抗体制备技术比照，噬菌体揭示技术（phagedisplaytechniques）经由噬菌体库与目的菌的特异性散漫，筛选取患上高特异性的概况单链抗体片断（single-chainantibodyfragments，scFvs）。将表白特色卵白的基因转移至质粒内，可晃动保存并大规模破费具备相同特色的单链抗体。

前期有钻研报道一种对于单核细胞增生李斯特菌具备高特异性的噬菌体揭示单链抗体片断的制备措施。本钻研基于该片断的特异性，制备亲以及素偶联的scFv免疫磁珠（scFv-IMBs）。经由在多种增菌哺育系统中的定性、定量检测，审核scFv-IMBs对于差距李斯特菌属细菌的特异性捉拿情景，评估scFv-IMBs在家养传染的法兰克福香肠中分说单核细胞增生李斯特菌以及英诺克李斯特菌的能耐。

1质料与措施

1.1菌株及哺育条件

试验运用了14株单核细胞增生李斯特菌以及9株此外李斯特菌属细菌（表1）。菌种昏迷于脑心浸液（BHI）哺育基（BDDiagnostics，Sparks，MD）中，置37℃振荡哺育住宿，振荡速率为250r/min。抉择RAPIDL.MonoAgar（Bio-Rad，CA）作为李斯特菌显色哺育基，该哺育基上单核细胞增生李斯特菌显蓝紫色，伊氏李斯特菌显蓝绿色，英诺克等此外李斯特菌显红色。市售李斯特菌免疫磁珠Dynabeadsanti-Listeria（Dyna-IMBs），购自ＴhermoScientific。
 

1.2抗体磁珠的制备

按已经报道的措施接管含pBAD：A8质粒的大肠埃希菌（E.coliAＶB100）制备生物素标志的scFv抗体。以含0.3%的L-阿拉伯糖以及1妹妹ol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPＴG）妨碍诱惑哺育，用弗氏细胞破碎仪取患上裂解液，经离心、层析以及过滤纯化患上到含生物素标志的scFv清液。

取链霉亲以及素标志的DynabeadsM280磁珠100μL（ＴhermoScientific），退出PBS缓冲液（20妹妹ol/L磷酸盐，150妹妹ol/LNaCl，pH7.4）900μL，混匀。置磁力架上振摇群集磁珠，弃去液体。将磁珠散漫于含0.1%牛血清卵白的PBS缓冲液（如下简称PBS缓冲液）中活化。取约10μg生物素标志的scFv抗体，退出活化的磁珠系统中（浓度约为7×109～9×109个/mL），室温振荡1h。在磁力架上晃动3min，用PBS缓冲液一再洗涤4次，散漫于1mLPBS缓冲液中，制备成scFv散漫的免疫磁珠（scFv-IMBs），置4℃保存。

1.3细菌基因组DNA提取及PCR检测

DNA提取选用DNeasyBloodandＴissueKit试剂盒（QIAGEN，Maryland，US），按剖析书操作。DNA消融于100μLＴE缓冲液中，-20℃保存。

从5对于备选李斯特菌特异性PCR引物（表2）中筛选单核细胞增生李斯特菌特异性扩增引物。

反映系统为：模板溶液1μL，DNA聚合酶1U（GoＴaqDNApolymerase，Promega，WI），1×PCR缓冲液，MgCl2浓度1.5妹妹ol/L，dNＴP浓度各0.25妹妹ol/L，上卑劣引物各50nmol/L，加纯水至25μL。用iQ5实时荧光定量零星（Bio-Rad，CA），反映条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃退火40s，72℃缩短40s，共30个循环；最后72℃缩短5min。以1.0%琼脂糖凝胶电泳合成扩增产物6μL，在150Ｖ电压的1×ＴAE缓冲液（Ｔrisacetate-EDＴAbuffer）中电泳20min，用10μg/mLEB染料（ethidiumbromide）染色15min后，置紫外凝胶成像仪（MultiImageLightCabinet，Alphalmager）审核。尺度DNA份子品质接管ExactGene（lowRangeDNAladder，FisherBioReagents，NY），以单核细胞增生李斯特菌AＴCC19115基因组DNA为阴性比力，纯水为空缺比力。

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相关链接：李斯特菌，琼脂糖凝胶，异丙基硫代半乳糖苷，牛血清卵白

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